近日，Advanced Science在线发表了江南大学生物工程学院和未来食品科学中心陈坚院士团队张国强研究员课题组的研究成果“CRISPR-DNA Polymerase Assisted Targeted Mutagenesis for Regulable Laboratory Evolution”。
定向进化是工业酶改造与代谢途径优化适配的重要策略。相较于传统技术手段，体内连续进化无需进行体外基因反复克隆与转化，大幅减少人为干预，提升进化效率，已被广泛应用于蛋白质工程及合成生物学研究。基因组靶向体内连续进化能够直接在生物体内驱动特定基因组区域的连续进化，为开发高性能微生物底盘与优化细胞工厂提供有力工具。然而，现有基因组靶向体内连续进化系统仍受限于体内创建多样性突变库的效率，具体表现为诱变窗口窄、碱基突变类型有限、脱靶效应控制不足以及跨物种通用性低等技术瓶颈。
针对上述问题，研究团队基于高扩增性能的噬菌体DNA聚合酶与CRISPR-nCas9建立了高效可控的基因组靶向体内连续进化系统（CTRLE），并将其应用于基因组位点的连续进化以获得具有特定表型的菌株。研究人员首先基于DNA切口酶引导易错DNA聚合酶靶向突变机制，将高持续合成能力的噬菌体T5或T7 DNA聚合酶与nCas9蛋白融合，建立了具有宽诱变窗口（2kb）、全部12种碱基突变类型的体内靶向突变系统。其次，为优化系统性能，采用MS2-MCP蛋白招募策略取代传统融合表达，在维持高突变率的同时，脱靶率可降低54.8%-96.8%。同时，通过引入基于dTnpB的转录抑制系统，实现了对连续进化过程的调控。为验证该系统的多位点进化效率，研究人员利用CTRLE分别连续进化大肠杆菌基因组中与耐药性相关的三个基因和双精氨酸蛋白转运途径，短期内成功获得了具有三种抗生素抗性的进化菌株和周质蛋白转运效率提升超3倍的突变体。最后，研究人员进一步将CTRLE成功应用于革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌和真核微生物乳酸克鲁维酵母，靶向突变率可提升105倍-107倍。本研究构建的宽窗口、低脱靶、多位点、可调控的微生物体内连续进化系统为工业酶与微生物细胞工厂改造提供了高效工具平台（图1）。
生物工程学院2021级博士生陈帅丽为第一作者，张国强研究员为论文通讯作者。上述研究得到了国家重点研发计划（2024YFA0918300）、国家自然科学基金（32172153）和江苏省自然科学基金（BK20202002）等项目的资助。
近年来陈坚院士团队张国强研究员课题组以酶工程与合成生物学科学理论为指导，在工业酶/菌种超高通量定向进化、微生物蛋白表达系统设计适配、功能食品开发应用等方面开展系统研究，相关研究成果已发表在Advanced Science、ACS Catalysis、Metabolic Engineering、Bioresource Technology、Trends in Food Science & Technology、Journal of Agricultural and Food Chemistry等本领域权威期刊。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202511448
图1 CRISPR-DNA聚合酶介导的可控体内连续进化系统开发与应用
